Settembre 3, 2021
I bioingegneri hanno riproposto un sistema CRISPR “non funzionante” per creare una versione più piccola dello strumento di ingegneria del genoma. Le sue dimensioni ridotte dovrebbero facilitare la somministrazione nelle cellule umane, nei tessuti e nel corpo per la terapia genica.
L’analogia comune per l’editing genetico CRISPR è che funziona come forbici molecolari, tagliando sezioni selezionate di DNA. A Stanley Qi, assistente professore di bioingegneria alla Stanford University, piace questa analogia, ma pensa che sia ora di reinventare CRISPR come un coltellino svizzero.
“CRISPR può essere semplice come un cutter o più avanzato come un regolatore, un editor, un’etichettatrice o un imager. Molte applicazioni stanno emergendo da questo entusiasmante campo”, ha affermato Qi, che è anche assistente professore di chimica e biologia dei sistemi nella Stanford School of Medicine e uno studioso dell’istituto Stanford ChEM-H.
I numerosi e diversi sistemi CRISPR in uso o in fase di sperimentazione clinica per la terapia genica delle malattie dell’occhio, del fegato e del cervello, tuttavia, rimangono limitati nella loro portata perché soffrono tutti dello stesso difetto: sono troppo grandi e, quindi, troppo difficile da trasportare nelle cellule, nei tessuti o negli organismi viventi.
In un articolo pubblicato il 3 settembre su Molecular Cell, Qi e i suoi collaboratori annunciano quello che ritengono sia un importante passo avanti per CRISPR: un mini sistema CRISPR efficiente, multiuso. Considerando che i sistemi CRISPR comunemente usati – con nomi come Cas9 e Cas12a che denotano varie versioni di proteine associate a CRISPR (Cas) – sono composti da circa 1000 a 1500 amminoacidi, il loro “CasMINI” ha 529.
I ricercatori hanno confermato negli esperimenti che CasMINI potrebbe eliminare, attivare e modificare il codice genetico proprio come le sue controparti più robuste. Le sue dimensioni ridotte significano che dovrebbe essere più facile da somministrare nelle cellule umane e nel corpo umano, rendendolo un potenziale strumento per il trattamento di diversi disturbi, tra cui malattie degli occhi, degenerazione degli organi e malattie genetiche in generale.
Sforzo persistente
Per rendere il sistema il più piccolo possibile, i ricercatori hanno deciso di iniziare con la proteina CRISPR Cas12f (nota anche come Cas14), perché contiene solo circa 400-700 amminoacidi. Tuttavia, come altre proteine CRISPR, Cas12f proviene naturalmente da Archaea – organismi unicellulari – il che significa che non è adatto alle cellule dei mammiferi, per non parlare delle cellule o dei corpi umani. Solo poche proteine CRISPR sono note per funzionare nelle cellule di mammifero senza modifiche. Sfortunatamente, CAS12f non è uno di questi. Questo lo rende una sfida allettante per i bioingegneri come Qi.
“Abbiamo pensato, ‘Ok, milioni di anni di evoluzione non sono stati in grado di trasformare questo sistema CRISPR in qualcosa che funziona nel corpo umano. Possiamo cambiarlo in uno o due anni?'”, ha detto Qi. “Per quanto ne so, per la prima volta abbiamo trasformato un CRISPR non funzionante in uno funzionante”.
In effetti, Xiaoshu Xu, uno studioso post-dottorato nel laboratorio di Qi e autore principale dell’articolo, non ha riscontrato alcuna attività del Cas12f naturale nelle cellule umane. Xu e Qi hanno ipotizzato che il problema fosse che il DNA del genoma umano è più complicato e meno accessibile del DNA microbico, rendendo difficile per Cas12f trovare il suo bersaglio nelle cellule. Osservando la struttura computazionalmente prevista del sistema Cas12f, ha scelto con cura circa 40 mutazioni nella proteina che potrebbero potenzialmente aggirare questa limitazione e ha stabilito una pipeline per testare molte varianti proteiche alla volta. Una variante funzionante, in teoria, trasformerebbe una cellula umana in verde attivando la proteina fluorescente verde (GFP) nel suo genoma.
“In un primo momento, questo sistema non ha funzionato per un anno”, ha detto Xu. “Ma dopo le iterazioni della bioingegneria, abbiamo visto alcune proteine ingegnerizzate iniziare ad attivarsi, come per magia. Ci ha fatto apprezzare davvero il potere della biologia sintetica e della bioingegneria”.
I primi risultati positivi furono modesti, ma eccitarono Xu e la incoraggiarono ad andare avanti perché significava che il sistema funzionava. Nel corso di molte iterazioni aggiuntive, è stata in grado di migliorare ulteriormente le prestazioni della proteina. “Abbiamo iniziato vedendo solo due cellule che mostravano un segnale verde e ora, dopo l’ingegneria, quasi tutte le cellule sono verdi al microscopio”, ha detto Xu.
“Ad un certo momento, ho dovuto fermarla”, ha ricordato Qi. “Ho detto ‘Per ora va bene. Hai realizzato un sistema piuttosto buono. Dovremmo pensare a come questa molecola può essere utilizzata per le applicazioni.'”
Oltre all’ingegneria delle proteine, i ricercatori hanno anche progettato l’RNA che guida la proteina Cas verso il suo DNA bersaglio. Le modifiche a entrambi i componenti sono state fondamentali per far funzionare il sistema CasMINI nelle cellule umane. Hanno testato la capacità di CasMINI di eliminare e modificare i geni nelle cellule umane di laboratorio, compresi i geni correlati all’infezione da HIV, alla risposta immunitaria antitumorale e all’anemia. Ha funzionato su quasi tutti i geni che hanno testato, con risposte robuste in diversi.
Aprendo la porta
I ricercatori hanno già iniziato a mettere insieme collaborazioni con altri scienziati per perseguire terapie geniche. Sono anche interessati a come potrebbero contribuire ai progressi nella tecnologia dell’RNA
Fonte:
Materials provided by Stanford University. Original written by Taylor Kubota. Note: Content may be edited for style and length.
Riferimenti:
- Xiaoshu Xu, Augustine Chemparathy, Leiping Zeng, Hannah R. Kempton, Stephen Shang, Muneaki Nakamura, Lei S. Qi. Engineered miniature CRISPR-Cas system for mammalian genome regulation and editing. Molecular Cell, 2021; DOI: 10.1016/j.molcel.2021.08.008
Stanford University. “Engineered ‘mini’ CRISPR genome editing system developed.” ScienceDaily. ScienceDaily, 3 September 2021. <www.sciencedaily.com/releases/2021/09/210903132554.htm>.